微生物代谢很火但要咋搞？看看 Nature 推的三板斧

这是《肠道产业》第 311 篇文章

编者按：

定植在人体表面与内部的微生物会进行复杂的生化反应，而我们目前研究微生物的主流方法却依赖于对微生物基因组的测序。虽然二代测序技术能够为我们提供许多关于微生物组的重要信息，但是这些信息依然是有限的。

不过，随着科学技术的发展，现在出现了越来越多的新技术（比如类器官技术、代谢组学等），这些技术可以应用于微生物组研究，帮助我们进一步探究微生物。

今天，我们特别编译了一篇发表于 Nature 杂志上关于如何挖掘微生物代谢产物的文章，为大家介绍一些可用于研究微生物代谢物的新手段，希望本文能够为相关的产业人士和诸位读者们带来一些启发与帮助。

手段1：化学生物学分析

长期以来，我们一直依赖于 DNA 测序来研究生活在动物体内和表面的微生物。通过这种技术手段，我们通常只能揭示不同种类微生物的丰度以及这些微生物群落在不同的环境下会发生怎样的组成变化。

不过现在，我们可以将化学生物学的分析方法与基因组学和计算技术相结合，从生物化学的角度去洞察这些微生物到底在做什么。

一些实验室正在利用质谱技术和越来越多的数据库以及生物信息学工具来分析微生物数据，关注微生物代谢食物时产生的物质。这些代谢物不仅是用来判断健康或疾病的标志物，而且还是促进各种生理变化的“引擎”¹。

代谢物不仅可以影响微生物所定植的组织（比如肠道菌群影响肠道健康），还会影响整个宿主的生理状态。

加州斯坦福大学的微生物学家 Michael Fischbach 说，一些菌群代谢的化合物在血液中含量很高，其含量在个体之间的差异可能超过一个数量级。“我们应该进一步探究这些化学物质，因为它们可能是人与人之间生物学差异的基础。”

然而，众所周知的代谢物研究——代谢组学说起来容易，做起来难。

纽约州立大学环境科学与林业学院的生物化学家 Erica Majumder 研究的是肠道微生物的硫代谢，他说：“在任何一个代谢组学研究中，我们都会检测出数千种代谢物。”

如果研究人员想要用液相色谱-质谱（LC-MS）技术分析代谢物，那么鉴定这些生物分子可能需要耗费数月的心血。

生物化学家 Gary Siuzdak 说：“这真的是一个令人难以置信，也是令人沮丧的过程。”他在加州拉由拉市的斯克利普斯研究所（Scripps Research）进行相关的研究。1995 年，他们团队发表了一篇代谢组学的文章，这是最早利用 LC-MS 方法探究代谢物的论文之一²。

从那时起，研究人员开始改进仪器和分析工具，从而大大缩短了分析所需要的时间。

Siuzdak 的实验室创建了一个名为 METLIN 的质谱数据库，它包含了超过 50 万个代谢物和其它分子的结构细节。他们实验室还开发了一个叫做 XCMS 的在线平台，用于处理 LC-MS 数据。

另一个工具——全球自然产物社会分子网络（Global Natural Product Social Molecular Networking）是由化学家 Pieter Dorrestein 和他的同事在加州大学圣地亚哥分校创建的。它提供了海量的质谱数据，当没有官方参考标准时，研究人员可以使用这些数据来识别代谢物。

Siuzdak 说，尽管还有很多工作要做，但这样的工具已经可以在几秒钟内识别出一些代谢物。

Dorrestein 说，2016 年的时候，还只有不到 2%的质谱信号可以与已知的代谢物相匹配，现在，这个数字已经增加了两到三倍。

图. 像这些口腔细菌一样，微生物可以深刻地影响宿主的生理。图片来源：Steve Gschmeissner / SPL

手段2：基因组学技术

基因组学技术也为探索微生物开辟了道路。欧洲分子生物学实验室的计算生物学家 Maria Zimmermann-Kogadeeva 在两项研究中探究了同一个关键问题：微生物组如何影响宿主的药物代谢。

第一项研究³是她在耶鲁大学做博士后时进行的，Zimmermann-Kogadeeva 和她的同事们研究了肠道微生物代谢抗病毒药物——溴夫定（brivudine）的过程。

（编者注：溴夫定适应症为免疫功能正常的成年急性带状疱疹患者的早期治疗。）

Zimmermann 的研究团队给野生型小鼠和缺乏微生物的小鼠分别注射 brivudine，然后检测了药物及其代谢物的浓度随时间的变化。在鉴定出代谢药物速度最快的微生物菌株后，他们一一失活了这种细菌的 2350 个基因，以确定负责代谢该药物的酶。

接下来，研究人员让缺乏这种酶的细菌定植于无菌小鼠，以建立宿主-微生物药物代谢的药代动力学模型。通过这种方法，研究人员可以评估微生物对食物、其他药物或内源性代谢物消化的贡献。

Zimmermann 和她的团队还试图更广泛地量化微生物对口服药物的影响。他们分析了 76 种肠道微生物对 271 种口服药物的体外代谢，发现所有微生物都参与代谢了一些药物，研究中 65%的药物至少可被一种微生物菌株代谢⁴。

研究团队随后建立了细菌库，每个库都可以表达部分感兴趣的基因，从而确定负责这种代谢活动的细菌基因，并用质谱法对其进行量化。

关于上述研究《热心肠日报》做过相关报道：

Science：肠道菌群对药物代谢的贡献有多大？

Science——[41.845]

① 宿主和肠道细菌共同参与药物代谢，药物反应的个体差异性与肠道菌群的基因差异有关；② 利用无菌小鼠、药物代谢酶缺失细菌构建限菌小鼠模型，发现核苷类抗病毒药物溴夫定转化为肝毒性代谢物的过程，71%由肠道菌群完成；③ 该模型可用于定量测定宿主和肠道菌群对药物代谢的贡献，并成功检测了抗病毒药索利夫定的代谢情况；④ 利用无菌小鼠构建类似模型，证明肠道细菌参与了氯硝安定及相关药物的还原过程，该代谢过程也与药物毒性相关。

Separating host and microbiome contributions to drug pharmacokinetics and toxicity
2019-02-08, doi: 10.1126/science.aat9931

【主编评语】肠道菌群参与药物代谢过程。Science近期发表了一篇方法学研究，阐述了一种可定量测定肠道菌群对药物代谢贡献的方法，测定了肠道细菌对若干核苷类抗病毒药物、抗焦虑药物的代谢影响。该模型对评估肠道菌群在药物、营养成分等物质代谢过程中的作用具有重要参考价值。（@周旸）

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Nature：对肠道菌群药物代谢作用的系统性研究

Nature——[42.778]

① 分析76种/株人肠道细菌对271种口服药物的体外代谢，2/3的药物可被至少1株菌代谢，代谢活性与细菌类别和药物结构有关；② 用高通量方法在菌群中系统性鉴定细菌生成的药物特异性代谢物，以及代谢药物的细菌基因产物，确认了30个细菌酶可将20种药物转化为59种代谢物；③ 在小鼠中验证了特定菌和酶可直接而显著地影响特定药物的肠道和系统代谢，代谢药物的细菌基因及其同源基因在人肠道菌群中的丰度可部分解释药物代谢活性的个体差异。

Mapping human microbiome drug metabolism by gut bacteria and their genes
2019-06-03, doi: 10.1038/s41586-019-1291-3

【主编评语】口服药的疗效和副作用可能存在很大的个体差异，越来越多的证据显示肠道菌群在其中扮演重要角色。《Nature》上线来自耶鲁大学医学院Andrew L. Goodman团队的一项最新研究，系统性地分析了76种/株人类肠道菌对271种口服药物的代谢情况，鉴定出参与药物代谢的细菌基因及其产物，并在小鼠模型和人肠道菌群培养物中对部分发现进行了验证，加深了人们对肠道菌群参与药物代谢的分子机制的理解，为靶向菌群的个体化药物干预带来启示。有兴趣的读者不妨搭配着读一下该团队今年2月在Science发表的相关研究（http://www.mr-gut.cn/papers/read/1088767446），相信会有更多收获。（@mildbreeze）

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另一个问题是微生物代谢物对宿主的影响。

例如，吲哚丙酸是一种能改变肠壁通透性的物质，是由肠道细菌（如产孢梭菌）代谢饮食中的色氨酸所产生的。

然而，在 Fischbach 和斯坦福大学同事 Justin Sonnenburg 领导的研究团队通过生物信息学、基因敲除和质谱法确定相关的代谢途径之前，关于代谢色氨酸产生吲哚丙酸所涉及的步骤还不清楚⁵。

去年 12 月，该研究团队将自己的研究成果发表在了 Science 杂志，该研究描述了一种基于 CRISPR-Cas9 技术的系统，该系统可用于控制细菌代谢物的产生。同时，该团队还利用该系统揭示了某些代谢物在宿主免疫中的作用⁶。

关于该研究《热心肠日报》做过相关的报道：

Science：研究肠道菌产物对宿主影响的新利器

Science——[41.845]

① 开发一种基于CRISPR-Cas9的方法，可实现对肠道共生梭菌的多基因敲除；② 以生孢梭菌（Cs）为模式菌，成功敲除了10个Cs衍生分子（三甲胺、多种短链脂肪酸（SCFA）和支链SCFA等）合成通路中的基因；③ 并用质谱方法和无菌小鼠定植试验证实，得到的突变株无法产生相应的分子产物；④ 对比定植野生型Cs菌株和无法产生3种支链SCFA（异丁酸、2-甲基丁酸、异戊酸）的双基因敲除Cs突变株的小鼠，发现这些分子可调控宿主产生IgA的浆细胞。

Depletion of microbiome-derived molecules in the host using Clostridium genetics
2019-12-13, doi: 10.1126/science.aav1282

【主编评语】肠道菌群可产生大量多样化的生物活性分子，对宿主的生理活动和健康产生影响。然而由于缺乏相应的遗传操纵工具，人们一直难以深入分析特定细菌产物对宿主的影响和作用机制。比如哺乳动物肠道中常见的共生梭菌，就是一类难以进行遗传操纵的细菌。Science最新上线的一项研究报道了一种可对梭菌进行多基因敲除的方法，并通过小鼠定植实验，发现生孢梭菌产生的支链短链脂肪酸对宿主的免疫调控功能。这种方法不仅可研究梭菌等细菌产生的分子对宿主的影响，也可通过编辑特定细菌的基因组，实现对特定菌群产物的调控。（@mildbreeze）

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研究人员还利用类似于器官，但是更为简单的实验室培养组织，也就是类器官来阐明微生物代谢物的影响。

北卡罗来纳大学教堂山分校的干细胞生物学家 Scott Magness 和生物工程师 Nancy Allbritton 开发了一套系统，用于分析在独立的培养孔中生长的 15000 个类器官——所有这些类器官都生长于一个邮票大小的方形中⁷。

该团队使用现成的 3D 打印组件构建了这个系统，并使用显微镜和计算图像分析建立了一个自动监控系统。Magness 说：“你永远不会让一个研究生或博士后数 15,000 个孔。” 

研究人员使用另一个自动化系统将健康供者粪便样本中的细菌注射到肠道类器官中，注射速度约为每小时 90 个类器官（手动注射每小时只能处理 12 个类器官）。通过在细菌周边注射荧光染料，研究人员可以判断微生物代谢物是否破坏了肠道屏障功能⁸。

他们还证明，该系统可以支持厌氧微生物的生长，而厌氧微生物在人体肠道中占据主导地位。

Magness 说：“我们向你展示了如何‘注射’复杂的微生物群落，而且这些群落可以在几天内维持稳定。”

图.类器官可以帮助我们探究微生物的影响。图片来源：Prisca Liberali和Denise Serra

手段3：数据挖掘工具

这些工具可以帮助我们分辨微生物组的微生物化学活性。但是为了开发和理解代谢组学，研究人员还需要利用数据挖掘等工具。

例如，一个名为代谢物注释和基因整合（MAGI）的网络工具使用已知的生化途径生成代谢物-基因关联评分，帮助研究人员将遗传序列与代谢组学数据关联起来⁹。

MAGI 的开发者、劳伦斯伯克利国家实验室的 Trent Northern 说：“鉴定代谢物是非常有挑战性的。同样，鉴定基因在基因组中的功能常常也是非常困难的。而 MAGI 可以识别彼此之间存在联系的代谢组学和基因组学数据，并将这些信息组合起来帮助我们识别代谢物，以及鉴别基因。”

Siuzdak 说，数据挖掘工具还可以帮助研究人员了解研究文献中的重要内容。“这是一类新技术，使我们能够更快地破译代谢组学数据。”

一篇在审的论文中，Majumder 描述了一种策略，即科学文献挖掘，寻找在特定生物学背景下预测代谢功能的线索。她用这种方法来鉴定特定的代谢物——有助于逆转多发性硬化症中的神经变性的代谢物。

她说，该工具收集到的一些论文“是我们从传统搜索中找不到的，并且这些论文提供了直接证据来解释我们发现的某些情况”。

参考文献：

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1.Rinschen, M. M., Ivanisevic, J., Giera, M. & Siuzdak, G. Nature Rev. Mol. Cell Biol. 20, 353–367 (2019).2.Cravatt, B. F. et al. Science 268, 1506–1509 (1995).3.Zimmermann, M., Zimmermann-Kogadeeva, M., Wegmann, R. & Goodman, A. L. Science 363, eaat9931 (2019).4.Zimmermann, M., Zimmermann-Kogadeeva, M., Wegmann, R. & Goodman, A. L. Nature 570, 462–467 (2019).5.Dodd, D. et al. Nature 551, 648–652 (2017).6.Guo C J, Allen B M, Hiam K J. Science, 2019, 366(6471).7.Gracz, A. et al. Nature Cell Biol. 17, 340–349 (2015).8.Williamson, I. A. et al. Cell. Mol. Gastroenterol. Hepatol. 6, 301–319 (2018).9.Erbilgin, O. et al. ACS Chem. Biol. 14, 704–714 (2019).

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原文链接：https://www.nature.com/articles/d41586-019-02853-5

作者｜Esther Landhuis

编译｜赵婧

审校｜617

编辑｜笑咲

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